La muerte celular y la enfermedad – La sobreexpresión …

La muerte celular y la enfermedad - La sobreexpresión ...

Citación: La muerte celular y la enfermedad (2016) 7. e2358; doi: 10.1038 / cddis.2016.262
Publicado en línea 1 de septiembre de el año 2016

La sobreexpresión de JARID1B promueve la diferenciación a través de la señalización de AKT SHIP1 en carcinoma de células escamosas de la hipofaringe humana
Abierto

Zhang Jisheng 1, 5. Un xiaofei 2, 5. 1. Yafei Han Rui Ma 3. Kun Yang Zhang Lu 1. 1. 1. Jingwei Chi Wei Li 1. David Llobet-Navas 4. Yan Xu Yan Jiang 3 y 1

  1. 1 Key Laboratory, Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao, Qingdao 266003, China
  2. Departamento de Endocrinología, Hospital de la provincia de Jiangsu de la medicina china, 155 Han Zhong Road, Nanjing 210029, China 2
  3. Departamento de Nefrología, Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao 3, 266 003 Qingdao, China
  4. 4 Instituto de Genética de la Universidad de Medicina-Newcastle, Newcastle upon Tyne NE1 3BZ, Reino Unido

Correspondencia: J Zhang, Yan Yan Xu o Jiang, clave Laboratorio, Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao, 16 de Jiangsu Road, Qingdao 266003, China. Tel: 0086 a 18661803157; Fax: 0086-532-82911999; E-mail: zhangjisheng76@hotmail.com. xuyanqyfy@126.com o jiangyanoto@163.com

5 Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Recibido el 21 de marzo de de 2016; Revisado 26 de de junio de de 2016; Aceptado 14 de de julio de el año 2016

Abstracto

abreviaturas:

HPSCC, carcinoma de células escamosas de la hipofaringe; Chip, la inmunoprecipitación de la cromatina; IHC, inmunohistoquímica; Tan IIA, IIA tanshinone; O E, que sobreexpresan

resultados

JARID1B se sobreexpresa en el HPSCC moderada y alta diferenciado

Figura completa y la leyenda (141K)

La expresión forzada de JARID1B conduce a la diferenciación celular FaDu

Para evaluar el papel potencial de JARID1B en la regulación de la diferenciación HPSCC, Bandera-JARID1B se sobreexpresa en las células FaDu, procedentes de un carcinoma de células escamosas de la hipofaringe. A medida que la sobreexpresión esperado de JARID1B aumentó el nivel de expresión de ARNm en K10 FaDu células (Figura 2a). Tratamos de explorar más marcadores epiteliales de queratina tales como K13, pero por desgracia no hemos encontrado ninguna otra diferenciación de genes marcadores fiables. Por lo tanto, en este estudio sólo utilizamos K10 como un marcador de diferenciación. En consonancia con los resultados de la RT-PCR, obligó expresión de JARID1B dio lugar a la elevación de K10 a nivel de proteína. Además, H3K4me3 se downregulated después de la expresión JARID1B (Figura 2b). Para evaluar la importancia de JARID1B en el control de la expresión de K10, analizamos correlación entre estos dos niveles de ARNm de genes normalizados con el tejido normal adyacente en todas las muestras HPSCC 34. Se obtuvo una correlación alta positiva entre los niveles de mRNA de JARID1B y K10 (R 0.721, PAG 0,01), lo que sugiere que el nivel de expresión JARID1B es un factor influyente importante para la expresión de K10 HPSCC (Figura 2c). Ha sido bien documentado que JARID1B agotamiento inhibió la proliferación de células de cáncer. Pero, ¿cómo la sobreexpresión de JARID1B afecta el crecimiento celular ha sido ignorarse. Overexpressed JARID1B o control en las células FaDu y ejerció ensayo CCK8 para medir la proliferación celular. Inesperadamente, la regulación positiva de JARID1B inhibe la proliferación de células FaDu comparación con el control (Figura 2d). Los resultados son consistentes con la tinción IHC, que mostró que HPSCCs de alto diferenciados tienen alta JARID1B y expresión de Ki67 baja (Figuras 1c y d). Estas observaciones sugirieron que JARID1B puede afectar el crecimiento de células de cáncer a través de diferentes mecanismos.

Figura completa y la leyenda (105K)

Desmontables de JARID1B reprime la transcripción K10

A continuación desmontables JARID1B con lentivirus shRNA para validar aún más el papel de JARID1B en el control de la diferenciación celular FaDu. JARID1B ARNm y la expresión de la proteína se ha reducido notablemente después de la infección 72   h (complementario de las figuras S2A y 2e). En comparación con el control de la expresión de ARNm K10 disminución en el agotamiento de JARID1B (Figura S2 B). Sin embargo, la expresión de la proteína K10 era indetectable incluso con una larga exposición, mientras que las células HaCaT mucho menos cargados-mostraron una banda muy fuerte (Figura S2C). Nuestros resultados son consistentes con características de células FaDu pobremente diferenciado. Por último, el ensayo de CCK8 se realizó para medir la proliferación celular con el agotamiento JARID1B. Caída con JARID1B shRNA lentivirus promovió la proliferación celular en comparación con el control (Figura 2e).

-señalización catenina se activa por la sobreexpresión de JARID1B

Figura completa y la leyenda (126K)

La sobreexpresión de JARID1B resulta en la activación de AKT

Figura completa y la leyenda (99K)

Ship1 está regulado por disminución en JARID1B sobreexpresión

Figura completa y la leyenda (123K)

Rescate de fenotipos JARID1B sobreexpresan por Ship1 en las células FaDu

Discusión

Hiperactivación de la vía PI3K Akt es un controlador de tumor universal que correlaciona con funciones de tumores celulares, tales como la proliferación, el metabolismo, invasión, metástasis y supervivencia. Por lo tanto, la señalización de PI3K podría ser una diana terapéutica importante y varias moléculas pequeñas se han desarrollado para antagonizar la actividad de la vía. Sin embargo, algunos resultados de los ensayos inhibidor de PI3K AKT sugieren que las respuestas profundas y sostenidas a los agentes individuales son poco frecuentes. Por otra parte, Caino et al. 40 han informado de que los inhibidores de PI3K actualmente en la clínica inducen reprogramación transcripcional global en tumores que mejoran la invasión celular y la motilidad. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la función de la vía PI3K AKT en diversos tumores necesita ser descubierto. Curiosamente, el informe reciente ha demostrado que el ácido trans-retinoico modula la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales a través de la activación de la PI3K AKT -catenina vía de señalización. 41 Aquí se describe la red JARID1B-Ship1-PI3K, que se asocia con el grado de diferenciación del cáncer. La función de la red JARID1B-regulatorio necesita ser explorado en otros tipos de tumores en los futuros estudios.

En resumen, hemos descrito la función molecular novela de JARID1B en HPSCC. Nuestros datos apoyan un papel clave para JARID1B en la mejora de la diferenciación celular en HPSCC, donde ha sido implicado para funcionar como un supresor de tumores inhibición de la proliferación celular de una manera dependiente de Ship1. Estos nuevos conocimientos sobre el papel de JARID1B en el tumor pueden desarrollar posibles estrategias de tratamiento para la HPSCC.

Materiales y métodos

la cultura y el tratamiento de los inhibidores de la célula

Se obtuvieron células FaDu de la ATCC y se cultivaron en medio DMEM con 10 suero bovino fetal y 1 penicilina estreptomicina. Las células fueron tratadas con inhibidores (Selleck, Shanghai, China) a la concentración indicada para el 24   marido.

Los plásmidos

Bandera-JARID1B se subclonó en el vector PiggyBac y se transfectaron con la ayuda de vectores. Para obtener la población de células que sobreexpresan JARID1B estable y pura se realizó la selección con 300   g ml de higromicina hasta que las células de control totalmente muerto. Ship1 fue subclonado en pcDNA3-Bandera del vector. Para la tinción de inmunofluorescencia subcloned JARID1B-bandera al vector PLENTI-GIII-CMV-IRES-Puro-SV40-GFP. Para conseguir población celular pura 2   g ml puromicina selección se realizó después de 24   h de la transfección. Luego cambiamos a medio nuevo después de 12   h cuando las células de control en blanco murieron por completo. Visualmente todas las células eran positivas para GFP bajo el monitor microscopio de fluorescencia. plásmidos JARID1B shRNA se obtuvieron de Jikai Company. Las secuencias diana se podían encontrar en el cuadro complementario. Los plásmidos fueron transfectadas con Lipofectamine 3000 en las células siguiendo las instrucciones del fabricante.

El análisis de transferencia Western

Total de lisados ​​celulares o tisulares se prepararon con 1 SDS y se sometieron a ultrasonidos para romper el ADN. los datos de anticuerpos se pueden encontrar en el cuadro complementario. Cada inmunoblot se repitió tres veces contienen muestras procedentes de diferentes cultivos celulares. La intensidad relativa de las bandas de proteínas se midió con imagen NIH software J. Las transferencias se desarrollaron con sustrato Super Señal Pico (Pierce Biotechnology, Shanghai, China).

En tiempo real PCR de transcripción inversa

Chip

La inmunohistoquímica

inmunofluorescencia

Las células se fijaron durante 10   min en 4 PFA y se bloquearon durante 1   h con tampón de bloqueo. El anticuerpo primario se diluyó en solución de bloqueo y se incubó durante la noche a 4   C. Después del lavado, los anticuerpos secundarios se incubaron durante 1   h a temperatura ambiente. A continuación, se counterstained con DAPI para 5   min. Finalmente se montaron las células usando medios de montaje contra la decoloración.

In vitro ensayo de proliferación

In vitro ensayo de proliferación celular se llevó a cabo utilizando un Recuento celular Kit-8 (Dojindo CK04, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. En breve, se incubaron las células durante 30   min a 2   h después de la adición de 10   soluciones l CCK8 en 100   l de medio. A continuación, medir la absorbancia a 450   nm usando un lector de microplacas.

análisis estadístico

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Expresiones de gratitud

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