CD8 función de las células T-CMV específica …

CD8 función de las células T-CMV específica ...

Puntos clave

Expresión de marcadores de agotamiento se reduce en las células T CD8 + específicos de CMV de pacientes con LLC en comparación con los de los HC de la misma edad.

Funcionalidad de las células T CD8 + específicos de CMV en la LLC con respecto a la producción de citocinas, citotoxicidad y la formación de sinapsis inmunológica se conserva.

Abstracto

En la leucemia linfocítica crónica (LLC), T CD8 + células exhiben características de agotamiento y discapacidades funcionales. Sin embargo, reactivaciones de virus latentes como el citomegalovirus (CMV) son poco comunes en la LLC no tratados, lo que sugiere que las respuestas antivirales son sin compromisos. Se analizaron las características fenotípicas y funcionales de las células T CD8 + CMV-específicos en pacientes con LLC en comparación con los controles sanos emparejados por edad (HCS). A pesar de aumento de la expresión de los receptores inhibidores PD1, CD160, y CD244 sobre células totales T CD8 + en la LLC, los niveles de expresión de estos marcadores se redujeron en las células T CD8 + CMV-tetrámero +. En segundo lugar, la producción de citocinas tras la estimulación con forbol ambas células presentadoras de antígeno 13-acetato / ionomicina y CMV-péptido cargados-12-miristato estaba intacto en las células T CD8 + CMV-tetrámero +. células tercer lugar, CMV-tetrámero + T CD8 + de pacientes con LLC y HC fueron igualmente eficaces en la eliminación de células diana cargadas-CMV-péptido. Finalmente, citometría de flujo cuantitativa de imágenes reveló que la proporción de células T CD8 + que forman sinapsis inmunológicas con las células B cargados-CMV-péptido estaba intacto. En conclusión, a pesar de la evidencia de disfunción de las células T mundial en la LLC, se muestra aquí que las células T CD8 + específicos de CMV con LLC-derivados muestran una menor expresión de marcadores de agotamiento y son funcionalmente intactas. Estos datos indican que los cambios en el compartimento de células T en la LLC puede ser más heterogénea que en la actualidad supone.

Introducción

A pesar de estos defectos de células T globales, reactivaciones clínicamente relevantes de los virus latentes, como el CMV altamente inmunodominante son poco frecuentes en los pacientes con LLC no tratados. No (sub) reactivaciones CMV clínicos fueron encontrados en 2 cohortes independientes de pacientes con LLC no tratados. 13, 14 Además, en contraste con el aumento de la expresión informado de PD1 en las células T CD8 + totales, recientemente informaron de una disminución de expresión de PD1 en efector CD8 + (CD8 + CD45RA +/- CD27 -) y CD4 + (CD4 + CD45RA +/- CD28 -) las células T en pacientes con LLC. 14 Debido a que estas poblaciones se enriquecen para las células T específicos de CMV en los pacientes seropositivos para CMV, 12 Esto implica que la expresión de marcadores de agotamiento incluyendo PD1 también puede ser disminuido en las células T CD8 + CMV-tetrámero + de pacientes con LLC. Tomados en conjunto, estos datos indican que los defectos funcionales observados en las células T totales de pacientes con LLC no se apliquen en todos los subconjuntos (específico del virus) de células T en la misma medida. Hasta ahora, estudios que examinan las características fenotípicas y funcionales de las células T dirigidas específicamente a CMV en pacientes con LLC se carece.

Hemos caracterizado a fondo las células T CD8 + específicos de CMV en pacientes con LLC y se encontró que, en contraste con el aumento de la expresión en las células T CD8 + totales, la expresión de las moléculas inhibidoras PD1, CD160, y CD244 se redujo en CMV-tetrámero + CD8 + células T en comparación con la expresión en estas células de los controles sanos emparejados por edad (HCS). Además, encontramos que la función de las células T CD8 + dirigida por CMV estaba intacto con respecto a la producción de citoquinas, la capacidad citotóxica, y la capacidad de formar los IS adecuada.

métodos

materiales de pacientes y líneas celulares

La tinción de inmunofluorescencia y citometría de marcadores de agotamiento fluir

Los ensayos funcionales

El enriquecimiento de las células T CD8 +

Después de la descongelación, las células CMV específicos de linfocitos T CD8 + se enriquecieron a través de agotamiento negativo usando microperlas CD19 inmunomagnéticas (Miltenyi Biotec), α-CD4 (10-A-12, n ° 69), α-CD19 (11g1, nr 156), α- CD14 (CLB-mon / 1, nr 143, 8G3), α-CD16 (CLB-FCRgran1, nr142, 5D2) (CLB, Amsterdam), y de oveja anti-ratón perlas magnéticas de inmunoglobulina-revestido (Invitrogen Dynal AS) en los HC y CLL como se describió anteriormente. 17 La pureza de las células T CD8 + específicos de CMV fue de alrededor de 1% a 2% dentro de las PBMC totales siguiente selección negativa con porcentajes similares entre los pacientes con LLC y HC. Las células se dejaron recuperar durante la noche a 37 ° C.

ensayo de citoquinas

ensayo de citotoxicidad

ensayo de sinapsis inmunológica

análisis estadístico

Se realizó la prueba de normalidad, todos d’Agostino y Pearson para evaluar la distribución normal de los conjuntos de datos. Debido a que los conjuntos de datos no se distribuyen normalmente, una de 2 colas de Mann-Whitney T Se utilizó la prueba para analizar las diferencias entre los grupos. UN PAG valor lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

resultados

Expresión de marcadores de agotamiento de las células T CD8 + específicos de CMV

Los niveles de expresión de las moléculas inhibidoras de CD160, CD244 y PD1 se midieron en células T CD8 + CMV-tetrámero + de pacientes con LLC (n = 18) y HC de la misma edad (n = 7). Características de los pacientes con LLC y los HC se presentan en la Tabla 1 complementario, disponible en el Sangre El sitio web. se redujo la proporción de células T CD8 + que expresan CD160 y PD1 en pacientes con LLC CMV-tetrámero +. Además, la intensidad media geométrica de fluorescencia (MFI) de CD160, CD244, y PD1 en CMV-tetrámero + + T CD8 células de pacientes con LLC se redujo significativamente en comparación con el MFI de CMV-tetrámero + células de emparejados por edad + T CD8 HC (Figura 1A).

En contraste, el análisis de los niveles de expresión de los marcadores de agotamiento de las células T CD8 + totales procedentes de pacientes con LLC (n = 38) en comparación con las células T CD8 + totales a partir de HC (n = 13) mostró un aumento significativo en números absolutos de + T CD8 las células que expresan CD160 y un aumento significativo tanto en la proporción y el número absoluto de células T CD8 + que expresan CD244 y PD1 (Figura 1C), de acuerdo con las riquezas y col. 7

Así, en contraste al total de células T CD8 +, CMV-tetrámero + células T CD8 + de CLL pacientes muestran una disminución en la expresión de marcadores de agotamiento en comparación con las células T CD8 + tetrámero + CMV-derivado de HC de la misma edad.

las respuestas de citoquinas de las células T CD8 + específicos de CMV

En resumen, se encontró que las respuestas de citoquinas de las células T CD8 + específicos de CMV derivadas de pacientes con LLC que está intacta.

respuesta citotóxica de las células T CD8 + específicos de CMV

Tomados en conjunto, estos datos muestran que la función de las células T CD8 + específicos de CMV está intacto, también con respecto a la capacidad citotóxica.

ES formación de las células T CD8 + específicos de CMV

CD8 específicos de CMV+las células T de pacientes con LLC y HC son igualmente eficaces en la formación de sinapsis adecuados con APCs. Se incubaron las células (AE) + T Enriched CD8 (1 × 10 4) de pacientes con LLC y HC durante 30 minutos con cargado-CMV-péptido marcado con CFSE con HLA compatible-I EBV-LCLs (1 × 10 5) y fijaron con 2% de paraformaldehído. Las células se tiñeron para CD8 (CD8-APC), F-actina (PhTR), y un tinte nuclear (Hoechst) y adquiridas mediante ImageStream X100 (0,5-1,0 × 10 5 eventos). Como control negativo, se analizaron las células T CD8 + enriquecidos y nonloaded EBV-LCLs. agregados / de células B (A) de células T se identificaron utilizando CFSE vs parcelas bivariados CD8-APC. (B) Los dobletes fueron cerrada en su contenido en el colorante de unión a ADN Hoechst y agregados de células se descartaron. (C) Para identificar los IS adecuada, una puntuación sinapsis se calcula como una proporción de la intensidad máxima de píxel de la señal de PhTR (Max Px) en la interfaz / de células B de células T vs la intensidad media de pixel de la PhTR (Px media ) de la señal en la célula T CD8 +. (D) Esta puntuación identifica dobletes en el que la señal PhTR ha polarizado a la SI. (E) Porcentaje de dobletes que muestran un ISS formada adecuadamente (en relación a todos los dobletes) corregido para Fondo de la formación de sinapsis. Los puntos representan los individuos; n = 5 CLL, n = 3 HC con media ± SEM.

Discusión

Aproximadamente el 60% y el 80% de los adultos están infectados con CMV. En individuos sanos, la infección evoluciona en latencia asintomático después de la fase aguda. En contraste, durante la inmunodeficiencia, la infección por CMV puede causar complicaciones graves. 26 Sin embargo, a pesar de los defectos en la función inmune probablemente se originan temprano en el curso de la LLC, 2, 27, 28 reactivaciones CMV clínicamente relevantes son por lo general no se ve en los pacientes con LLC no tratados. 2 Nosotros y otros han encontrado consistentemente reacciones en cadena de la polimerasa del CMV negativos en pacientes seropositivos para CMV. 13, 14 Esto indica que la función de las células T CD8 + específicas clínicamente-CMV se conserva en la LLC, lo que corrobora los hallazgos in vitro.

Características fenotípicas de las células T específicas del virus varían en diferentes infecciones de virus latentes 30, 31, 33 y, como consecuencia corresponden a diferencias en la funcionalidad. 8, 34, 36, 37 si la funcionalidad conservado observado es única para las células CMV-específicos T CD8 + o también se aplica a los subconjuntos de células T con otras especificidades (dirigida por virus) no se ha estudiado hasta el momento. El hecho de que, en contraste con el CMV, reactivaciones de los virus del herpes virus del herpes simple y el virus de la varicela zoster son más prevalentes en la LLC 2, 38 sugiere que esto podría no ser el caso. Tomados en conjunto, en contraste con la vista actual de una disfunción de las células T global en CLL, 3 ⇓ -5, 7, 39 Nuestros datos indican que los subtipos de células T funcionales están presentes en estos pacientes. Esta observación podría implicar que la identidad antigénica y / o el estado de diferenciación de las células T juegan un papel en la susceptibilidad a los cambios fenotípicos y funcionales de LLC-inducida.

El aumento de expresión de PD1 se correlaciona con el agotamiento y la función de las células T alterada. Sin embargo, si PD1 es un inductor de agotamiento de células T y la funcionalidad deteriorada o simplemente una consecuencia del agotamiento de las células T es menos clara. Sin embargo, varias observaciones apoyan la idea de que la expresión de PD1 de hecho induce funcionalidad alterada de células T, 39 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ -44 que infiere que la amortiguación observado de la regulación al alza de PD1 en las células T CD8 + específicos de CMV podría ser mecánica relacionada a la función de las células T conservada en la LLC.

Paternidad literaria

Contribución: G.D.t.R. y M.F.P. experimentos diseñados y realizados, los datos analizados, y escribió el documento; J.J.G.-V. realizó citometría de flujo de imágenes, analizaron los datos, y revisó el manuscrito; E. R. realizó experimentos; E.B.M.R. caudal de diseño y análisis de citometría realizado experimentos; I.J.M.t.B. R.A.W.v.L. E.E. y M.H.J.v.O. contribuido al diseño de experimentos y revisado el manuscrito; y S.H.T. y A.P.K. diseñó el estudio, realizado el análisis de datos, y escribió el documento.

divulgación de conflicto de intereses: Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Correspondencia: Arnón P. Kater, Departamento de Hematología, Centro Médico Académico, Universidad de Amsterdam, Meibergdreef 9, 1105 AZ, Ámsterdam, Países Bajos; e-mail: a.p.kateramc.nl.

Expresiones de gratitud

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